Damian Sztucki

 

Kosmetyki i przybory toaletowe są produktami codziennego użytku, wykorzystywane do oczyszczania, perfumowania, upiększania lub ozdabiania ludzkiego ciała. Stosuje się je głównie na skórę lub włosy, ale niektóre, takie jak pasty do zębów i płyny do płukania ust, są również stosowane wewnętrznie. Kosmetyki nie mają na celu trwałej zmiany fizjologii narządu docelowego, chociaż niektóre z nich mogą zawierać substancję aktywne. Należą do nich kosmetyki, które pomagają np. w stanach zapalnych dziąseł, bądź skóry głowy. Mikrobiologia kosmetyków jest więc dziedziną szeroką i złożoną ze względu na szeroki wachlarz m.in. formulacji i ich wytwarzania.

 

Badanie mikrobiologiczne produktów kosmetycznych

Obowiązek badania czystości mikrobiologicznej produktów kosmetycznych i surowców przeznaczonych do ich produkcji wynika bezpośrednio z rozporządzenia Parlamentu Europejskiego i Rady (WE) nr 1223/2009 z dnia 30 listopada 2009 roku obowiązującego na terenie całej Unii Europejskiej. To samo rozporządzenie definiuje producenta wyrobów kosmetycznych, jako osobę gwarantującą spełnienie wszystkich wymagań, a więc odpowiedzialną, za jakość swoich produktów.

Mikrobiologia kosmetyków jest kluczowym elementem poświadczającym wymagany stopień jakości zapewniający bezpieczeństwo konsumentom. Każdy tego typu wyrób posiada zaświadczenie w postaci dwuczęściowego raportu bezpieczeństwa, który poświadcza o jego jakości. Pierwsza z nich zawiera informacje dotyczące bezpieczeństwa danego wyrobu, czyli m.in. jego składu, właściwości fizykochemicznych, wyników badań mikrobiologicznych, czy profile toksykologiczne użytych substancji. Druga, bardziej formalna, dotyczy m.in. informacji umieszczanych na etykiecie, czy kwalifikacji eksperta zatwierdzającego wystawianą ocenę. Na jego podstawie można wnioskować o bezpieczeństwie danego produktu kosmetycznego wprowadzanego przez producenta do obrotu.

Największe ryzyko pod względem zanieczyszczeń mikrobiologicznych stanowią kosmetyki zawierające w swoim składzie dużą zawartość wody, lub bazujące na niej. Organizmy powszechnie izolowane ze źle zakonserwowanych produktów na bazie wody obejmują gatunki: Klebsiella, Enterobacter, Staphylococcus i Bacillus, Pseudomonas, w tym P. aeruginosa, Burkholderia cepacia, Penicillium i Candida albicans. Bakterie Gram-ujemne są najpowszechniejsze, a ponieważ mają bardzo zróżnicowane zdolności metaboliczne, mogą przetrwać w wielu różnych środowiskach (w tym: deficyty wody, kwaśne pH). Woda w produktach kosmetycznych może być potencjalnym źródłem bakterii z grupy Pseudomonas ( w tym również Pseudomonas aeruginosa), czy Escherichia coli, które są drobnoustrojami patogennymi, a więc ich obecność w wyrobach kosmetycznych jest niedopuszczalna. Między innymi z tego właśnie powodu ważne jest, aby nie tylko kontrolować jakość mikrobiologiczną gotowych wyrobów, ale także poddawać okresowym badaniom surowce, takie jak woda produkcyjna.

W praktyce analizy czystości mikrobiologicznej przeprowadzane są w oparciu o Rozporządzenie Ministra Zdrowia z 23 grudnia 2002 Dz. U. nr 9, poz. 107, bądź odpowiednie normy PN EN ISO obejmujące w swoim zakresie badania ilościowe oraz jakościowe. Procedura badawcza wykonywana zgodnie z obowiązującymi normami ISO w przypadku oznaczeń ilościowych wygląda tak samo. Po naważeniu odpowiedniej ilości produktu oraz wprowadzeniu go do podłoża namnażającego np. Eugon LT 100 o pH zbliżonym do neutralnego (pH=7±0,2) należy utworzyć jego kolejne rozcieńczrnia. Następnie z każdego utworzonego rozcieńczenia należy pobrać 1ml i wylać do szalki Petriego, do której zostanie wylane odpowiednie podłoże wzrostowe umożliwiające wzrost potencjalnych drobnoustrojów. Do oznaczenia ogólnej liczby mezofilnych bakterii tlenowych zastosować należy podłoże mikrobiologiczne TSA (ang. Trypticasein Soy Agar), natomiast do oznaczenia ogólnej ilości drożdży i pleśni – podłoże SDA (ang. Sabouraud Dextrose Agar) w objętości około 15-20 ml na szalkę. Po zakończonym okresie inkubacji wszystkie kolonie obecne na podłożach należy zliczyć i uwzględnić przy interpretacji wyniku.

W celu weryfikacji obecności w danym produkcie bakterii Escherichia coli należy wykonać posiew na podłoże wybiórczo-różnicujące MacConkey’a, na którym pałeczki te utworzą ciemnoróżowe kolonie z charakterystyczną ciemnoróżową obwódką dookoła. Do izolacji ziarenkowców Staphylococcus aureus stosowane jest podłoże wybiórczo-różnicujące Baird-Parker’a, zawierające jako dodatek emulsję jajeczną z tellurynem potasu (ang. Egg’s Yolk Tellurite Sterile Emulsion). Wyrosłe na tym podłożu gronkowce koagulazododatnie będą miały czarny kolor z charakterystyczną strefą przejaśnienia dookoła. Z kolei do zaobserwowania obecności bakterii Pseudomonas aeruginosa wykorzystywane jest podłoże selektywne CET (ang. Cetrymide Agar) z dodatkiem cetrymidu, który spowoduje zahamowanie wzrostu flory towarzyszącej (w tym innych bakterii z rodzaju Pseudomonas) oraz wzmocni produkcję piocyjaniny (barwnika) przez ten gatunek.

Szukany drobnoustrój	Podłoże hodowlane	Numer i tytuł normy PN-EN ISO
Tlenowe mikroorganizmy mezofilne	TSA (bakterie), SDA (grzyby)	16212:2017-08 Kosmetyki. Mikrobiologia. Oznaczanie liczby drożdży i pleśni.                                                    21149:2017-07 Kosmetyki. Mikrobiologia. Zliczanie i wykrywanie mezofilnych bakterii tlenowych.
Escherichia coli	MacConkey Agar	21150:2016-01 Kosmetyki. Mikrobiologia. Wykrywanie obecności Escherichia coli
Staphylococcus aureus	Baird-Parker Agar	22718:2016-01 Kosmetyki. Mikrobiologia. Wykrywanie obecności Staphylococcus aureus.
Pseudomonas aeruginosa	Cetrimide Agar	22717:2016-01 Kosmetyki. Mikrobiologia. Wykrywanie obecności Pseudomonas aeruginosa.

Tabela 1. Wykaz norm PN-EN ISO wykorzystywanych do badań czystości mikrobiologicznej produktów kosmetycznych dla wybranych parametrów.

Test skuteczności i ocena zakonserwowania produktu

Test obciążeniowy został zaprojektowany przede wszystkim z myślą o produktach stanowiących wysokie ryzyko mikrobiologiczne, czyli między innymi kosmetykach bazujących w dużej mierze na wodzie (żele, kremy, balsamy). Badanie zakłada użycie pięciu patogennych mikroorganizmów (trzech bakterii, grzyba drożdżopodobnego oraz grzyba pleśniowego) w odpowiednim stężeniu i objętości, zaaplikowanych do produktu kosmetycznego umieszczonego na czas trwania badania w opakowaniu zastępczym i mierzeniu zmian w liczebności otrzymywanych drobnoustrojów w ustalonych odstępach czasowych. Produkt kosmetyczny można zakwalifikować do testu konserwacji jedynie po wcześniejszym wykazaniu jego czystości mikrobiologicznej.

Badanie obciążeniowe podzielone jest na kilka etapów rozłożonych w ustalonych odstępach czasowych. Pierwszym etapem (punktem T₀) jest kontrolowane, jednorazowe wprowadzenie szczepu referencyjnego do analizowanego produktu. Moment ten ma odzwierciedlać scenariusz wtórnej kontaminacji kosmetyku, do której może powstać podczas jego użytkowania, bądź na etapie produkcyjnym. Kosmetyki można w ten sposób badać z wykorzystaniem różnych mikroorganizmów, jednakże podstawowy wariant obejmuje te najpowszechniejsze, których obecność jest niedopuszczalna w rutynowym badaniu czystości mikrobiologicznej. Mowa tutaj o wspomnianych wcześniej: E. coli, S. aureus, P. aeruginosa, C. Albicans i A. brasiliensis.

Tak przygotowaną próbkę badaną (naważoną i zakażoną) poddaje się inkubacji w doprecyzowanych warunkach, a następnie w interwałach przypadających na: 7, 14 i 28 dni od momentu zakażenia weryfikacji przebiegu procesu neutralizacji drobnoustrojów. Polega to na pobraniu 1g lub 1ml takiego kosmetyku z opakowania, w którym jest inkubowany i dodania do 9ml przygotowanego neutralizatora (np. Eugon LT-100). Jego rolą jest neutralizacja działania konserwantu zawartego w produkcie kosmetycznym z jednoczesnym brakiem hamującego wpływu na rozwój mikroorganizmów, a więc będzie się przyczyniał do swobodnego namnażania zawartych drobnoustrojów, zakładając, że takowe przeżyły w danej formule konserwującej. W takiej postaci należy pozostawić kosmetyk w neutralizatorze przez 30±15 minut w temperaturze pokojowej.

Trudno jest przewidzieć skuteczność danego układu konserwującego podczas pierwszej analizy tj. 7 dni po kontaminacji. Z tego powodu zaleca się przygotowanie wielu rozcieńczeń badanego produktu, w celu jak najdokładniejszych wyliczeń. W momencie zaobserwowania braku dużo mniejszego wzrostu mikroorganizmów w porównaniu do T₀ można zakładać, że w kolejnych badaniach tj. T₁₄ i T₂₈ można zminimalizować ilość wykonywanych rozcieńczeń produktu. Zgodnie z informacjami zawartymi we wspomnianej normie ISO, po zakończonym okresie inkubacji wszystkie otrzymane kolonie z wszystkich rozcieńczeń należy policzyć, uwzględniając przy tym istotność wyników dla wszystkich mikroorganizmów w zakresie 30-300 kolonii, z wyjątkiem A.brasiliensis, dla którego zakres ten wynosi 15-150 kolonii. Jeśli liczba żywych drobnoustrojów zawiera się poza limitem, czyli wynosi więcej niż 300 (150 dla A.brasiliensis) bądź mniej niż 30 (15 dla A.brasiliensis), wynik taki należy podać jako wartość >300 (>150 dla A.brasiliensis) lub <30 (<15 dla A.brasiliensis).

I chociaż badanie to dedykowane jest przede wszystkim produktom kosmetycznym o dużej zawartości wody w ich składzie, nie jest to jednoznaczne z brakiem obowiązku testowania nawet tych klasyfikowanych jako produkty niskiego ryzyka mikrobiologicznego. Zgodnie z definicją zawartą w normie PN-EN ISO 29621:2017-04 są to produkty, których właściwości fizykochemiczne, albo technologia produkcji i przetwarzania uniemożliwiają rozwój lub przetrwanie mikroorganizmów. Produkty o wartościach pH < 3, bądź > 9, czyli mocno kwasowe lub zasadowe, zawierające w swojej formule alkohol etylowy ≥ 20%, amoniak ≥ 0,5% lub inne organiczne rozpuszczalniki zapobiegają wzrostowi drobnoustrojów.

Poza występującymi w kosmetykach konserwantami i niesprzyjającymi, skrajnymi warunkami wzrostowymi o niskim ryzyku zanieczyszczenia może świadczyć opakowanie produktu. Kosmetyki z mechanizmem aplikacji poprzez pompkę stanowią fizyczną barierę potencjalnej kontaminacji takiego produktu. Analogiczna sytuacja występuje w przypadku produktów przeznaczonych do jednorazowego użytku, czyli różnego rodzaju próbek, dla których z definicji wtórna kontaminacja jest niemożliwa. Dodatkowym czynnikiem sprzyjającym ograniczenie rozwoju mikroflory może być mała objętość opakowania ograniczająca liczbę użyć wyrobu, a więc skracająca czas użytkowania i narażenia na zanieczyszczenie. > 10%.

	Interwał czasowy badania
Referencyjny szczep testowy	Numer referencyjny	Po 7 dniach (T7)	Po 14 dniach (T14)	Po 28 dniach (T28)
Escherichia coli	ATCC 8739	+	+	+
Staphylococcus aureus	ATCC 6538	+	+	+
Pseudomonas aeruginosa	ATCC 9027	+	+	+
Candida albicans	ATCC 10231	+	+	+
Aspergillus brasiliensis	ATCC 16404	–	+	+

Tabela 2. Wykaz szczepów referencyjnych badanych w odpowiednich interwałach czasowych wyrażonych w dniach od momentu zaszczepienia produktu kosmetycznego.

Dobra Praktyka Produkcyjna – GMP

GMP (ang. Good Manufacturing Practice) powinna zapewniać, że produkty, choć niekoniecznie sterylne, nie zawierają organizmów szkodliwych oraz że łagodna populacja jest na niskim i stabilnym poziomie i/lub zmniejsza się w całym okresie życia produktu. Koniecznym pozostaje dodawanie chemicznych środków konserwujących do kosmetyków w celu powstrzymania namnażania się mikroorganizmów, które prawie nieuchronnie dostają się do nich po wytworzeniu. Ponieważ mikroorganizmy są wszechobecne w domu, zwłaszcza w ciepłych i wilgotnych pomieszczeniach, takich jak łazienki i kuchnie, kosmetyki i przybory toaletowe są narażone na zanieczyszczenie zarówno psuciem się, jak i potencjalnie niebezpiecznymi mikroorganizmami podczas ich użytkowania.

DPP stanowi zestaw procedur produkcyjnych, które w szczególności nastawione są na higienę produkcji i zapobieganie wytwarzaniu produktów niespełniających wymagań jakościowych, ale także zmienności cech produktów. Przestrzeganie tych zasad jest szczególnie ważne w przemyśle kosmetycznym, a także farmaceutycznym i spożywczym. Wynika to bezpośrednio z faktu bliskości i skali oddziaływania produkowanego produktu na życie i zdrowie konsumenta. Działania związane z GMP mają na celu zapewnienie powtarzalności i jednorodności produktów poprzez ścisły nadzór nad procesami produkcyjnymi od momentu zakupy surowców do zapakowania gotowego wyrobu. Stosowanie się do wymogów GMP gwarantuje producentom i konsumentom pewien poziom komfortu oraz zaufanie co do jakości otrzymywanego i dostarczanego produktu.

Podsumowanie

Stopień ryzyka mikrobiologicznego produktu zależy od jego właściwości, które mogą sprzyjać rozwojowi drobnoustrojów i prawdopodobieństwu wywołania przez nie efektów niepożądanych dla konsumenta. Wiele kosmetyków stanowi idealne środowisko dla wzrostu mikroorganizmów, dzięki optymalnym warunkom jakie zapewniają: duża zawartość wody, zawartość składników odżywczych, bądź ich stabilne i neutralne pH. Istnieją też produkty, dla których prawdopodobieństwo zakażenia jest bardzo niskie, dzięki niesprzyjającym dla bakterii i grzybów właściwościom. Na ochronę przeciwko rozwojowi mikroflory bakteryjnej i grzybiczej w produkcie kosmetycznym wpływają m.in.: skład formuły, warunki produkcji oraz opakowanie, w jakim się znajduje. W celu określenia wydajności zastosowanych środków ochronnych przeprowadza się standardowy test konserwacji. Aby zagwarantować, że dany produkt kosmetyczny posiada stabilny układ konserwujący, zaleca się przeprowadzanie badań obciążeniowych zarówno na etapie opracowywania receptury, jak i na gotowym produkcie końcowym znajdującym się w opakowaniu handlowym.

Bibliografia

1. Nowaczyk P., Merlak D., Limity mikrobiologiczne drobnoustrojów w produktach kosmetycznych według normy ISO/DIS 17516. Świat Przem. Kosm., 1, 2014, s. 54-55.
2. PN-EN ISO 16212:2017-08 Kosmetyki. Mikrobiologia. Oznaczanie liczby drożdży i pleśni.
3. PN-EN ISO 17516:2014-11 Kosmetyki. Mikrobiologia. Limit mikrobiologiczne.
4. PN-EN ISO 18416:2016-01 Kosmetyki. Mikrobiologia. Wykrywanie obecności Candida albicans.
5. PN-EN ISO 21149:2017-07 Kosmetyki. Mikrobiologia. Zliczanie i wykrywanie mezofilnych bakterii tlenowych.
6. PN-EN ISO 21150:2016-01 Kosmetyki. Mikrobiologia. Wykrywanie obecności Escherichia coli
7. PN-EN ISO 22717:2016-01 Kosmetyki. Mikrobiologia. Wykrywanie obecności Pseudomonas aeruginosa.
8. PN-EN ISO 22718:2016-01 Kosmetyki. Mikrobiologia. Wykrywanie obecności Staphylococcus aureus.
9. PN-EN ISO 29621:2017-04 Kosmetyki. Mikrobiologia. Wytyczne dotyczące oceny ryzyka i identyfikacji produktów o niskim ryzyku mikrobiologicznym.
10. Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 9 listopada 2015 roku w sprawie wymagań Dobrej Praktyki Wytwarzania.
11. Marczewska J., Mysłowska K., GMP w przemyśle farmaceutycznym. LAB, 2013
12. Perry B., Cosmetic microbiology. Microbiology Today, vol.28