System szybkiej identyfikacji drobnoustrojów w diagnostyce mikrobiologicznej

Damian Sztucki

Jednym z głównych celów przeprowadzania badań mikrobiologicznych w diagnostyce jest identyfikacja czynnika etiologicznego zakażenia oraz określenie jego profilu lekowrażliwości. Na przestrzeni lat naukowcy wymyślali nowe i udoskonalali istniejące metody identyfikacji mikroorganizmów, począwszy od obserwacji mikroskopowych, stosowania barwników i gamy podłóż mikrobiologicznych w celu różnicowania drobnoustrojów oraz wykorzystywania właściwości immunogennych i biochemicznych danych organizmów. Metody molekularne oraz zautomatyzowane techniki biochemiczne stanowią idealną alternatywę dla tradycyjnych metod identyfikacji biochemicznej z zastosowaniem pożywek hodowlanych.

Zasada działania

Określenie czynnika etiologicznego danego zakażenia oraz wykonanie profilu lekowrażliwości danego szczepu odgrywa bardzo istotną rolę w dobie narastającego zjawiska lekooporności mikroorganizmów na całym świecie. W sytuacji, w której do zalecenie efektywnej terapii kluczową rolę stanowi czas połączenie diagnostyki mikrobiologicznej z szeroko rozwiniętą bazą danych umożliwia szybkie uzyskanie pewnych wyników. Dzięki temu przepływ pracy laboratorium jest niezaburzony, zwiększa bezpieczeństwo, gwarantuje powtarzalność i generuje szybki, wiarygodny wynik.

Zautomatyzowane systemy mikrobiologiczne do szybkiej identyfikacji mikrobiologicznej wykorzystują technologie oparte na wzroście bakterii i grzybów. Po dostarczeniu do urządzenia przygotowanej zawiesiny pożądanego drobnoustroju system, w trakcie trwania inkubacji dokonuje automatycznej interpretacji materiału w oparciu o dane zawarte w bazie danych. Karty identyfikacyjne posiadają wbudowane studzienki, z których każda zawiera pewien substrat, który w kontakcie z zawiesiną bakteryjną może wykazywać różną aktywność metaboliczną (zakwaszenie, hydroliza substancji, wzrost w obecności inhibitora). Każda karta posiada wbudowaną rurkę, którą zaciągana jest zawiesina z drobnoustrojem i następnie rozdzielana na poszczególne studzienki z reagentami.

Po wyhodowaniu na podłożu mikrobiologicznym czystej kultury danego drobnoustroju i przygotowaniu zawiesiny o odpowiedniej gęstości optycznej można przystąpić do pracy z systemem. Poprzez skanowanie poszczególnej karty identyfikacyjnej/antybiogramowej przypisuje się ją do odpowiedniej zawiesiny, która posiada swój nadany przez nas kod/numer (najczęściej kod/ numer badanej próbki) [Tab.1]. W ten sposób można bezpośrednio utożsamiać uzyskany wynik z badanym izolatem. Po wczytaniu, zeskanowaniu i zapisaniu wszystkich informacji statyw z zawiesinami i przyporządkowanymi do nich kartami należy włożyć do aparatu, gdzie wypełniona zawiesiną kaseta zostaje przeniesiona manualnie lub automatycznie do komory próżniowej i po zweryfikowaniu wprowadzonych informacji nastąpi akceptacja dostarczonego materiału i rozpocznie się proces identyfikacji. Każda dostarczona do aparatu karta jest odczytywana przez system co 15 minut przez cały okres inkubacji (w temperaturze około 36oC).

Ze względu na dużą różnorodność mikroorganizmów, testy biochemiczne określające ich przynależność będą różniły się zasadniczo pomiędzy oraz w obrębie danej grupy (Gram dodatnie/Gram-ujemne/ Grzyby drożdżopodobne), rodziny i rodzaju. Z tego względu system wyposażony jest w kilka rodzajów kart identyfikacyjnych i antybiogramowych przypisanych dla poszczególnych grup: GN – przeznaczone do identyfikacji bakterii Gram-ujemnych, GP przeznaczone do identyfikacji bakterii Gram-dodatnich, YST umożliwia identyfikację ponad 49 rodzajów najbardziej znaczących pod względem klinicznym grzybów drożdżopodobnych. Patogenne grzyby drożdżopodobne, należące zwłaszcza do rodziny Candida, mogą wywoływać wiele ciężkich infekcji klinicznych, zwłaszcza u pacjentów z obniżoną odpowiedzią immunologiczną oraz mogą być źródłem zakażeń związanymi z opieką zdrowotną. W przypadku identyfikacji grzybów czas oczekiwania na wynik może trwać dłużej, niż w przypadku bakterii.; NH, czyli Neisseria, Haemophilus i inne bakterie o wysokich wymaganiach wzrostowych, które mogą odpowiadać za infekcje dróg oddechowych, a także za zapalenie opon mózgowych. Dla niektórych z tych organizmów wzrasta oporność na antybiotyki, dlatego właściwa decyzja terapeutyczna musi opierać się o dokładną i powtarzalną identyfikację oraz ANC (bakterie beztlenowe i Corynebacterium).

 

System szybkiej identyfikacji drobnoustrojów w diagnostyce mikrobiologicznej

Tabela 1. Wymagana gęstość optyczna zawiesiny przygotowanej do identyfikacji podana wg skali McFarlanda

 

Identyfikacja drobnoustroju zachodzi na drodze określenia jego profilu biochemicznego tj. zdolności rozkładu, asymilacji, bądź produkcji pewnych substratów i produktów. Do niektórych analizowanych zdolności należą: produkcja B- galaktozydazy, ureazy, lipazy; asymilacja sacharozy, maltozy, glukozy, laktozy, sorbitolu, rozkład tyrozyny, dekarboksylacja lizyny oraz ornityny. A ponadto 53 inne testy, które po podsumowaniu wszystkich „+” (oznaczających reakcję pozytywną) oraz „–” (oznaczających reakcję negatywną) wykreują profil biochemiczny badanego izolatu, który na podstawie bazy danych zostanie dopasowany i zidentyfikowany jako konkretny gatunek.

Oznaczenie lekowrażliwości izolatów

Drugim ważnym przeznaczeniem tego typu systemów jest oznaczanie lekowrażliwości izolatów wcześniej wyhodowanych na podłożach stałych. Lekowrażliwość może zostać określona zarówno równocześnie z identyfikacją, jak i niezależnie od niej. Karty antybiogramowe służące do tego celu zbudowane są analogicznie do tych identyfikacyjnych z tą różnicą, że zamiast substratów do określenia profilu biochemicznego w studzienkach znajdują się różnych klas antybiotyki. Dzięki nim można uzyskać wyniki lekowrażliwości i wykryć mechanizmy oporności u klinicznie istotnych ziarniaków Gram-dodatnich, pałeczek Gram-ujemnych oraz grzybów drożdżopodobnych.

W zestawie antybiotyków znajdują się np. leki powszechnie stosowane w zakażeniach dróg moczowych u pacjentów ambulatoryjnych, takie jak: ampicylina, amoksycylina z kwasem klawulanowym, cefalosporyny (cefuroksym, ceftazydym, cefepim), nitrofurantoina, norfloksacyna, ciprofloksacynę, lewofloksacyna oraz trimetoprim- sulfametoksazol. Obok leków typowo stosowanych w lecznictwie zamkniętym, takich jak amikacyna, gentamycyna, piperacylina-tazobaktam, ceftazydym, meropenem dodano dwa leki: drugi lek z grupy cefalosporyn III generacji – cefotaksym oraz lek z grupy karbapenemów – ertapenem, jako najczulszy wskaźnik pojawiającej się oporności na klasę antybiotyków zwanych karbapenemy. Ponadto wynik oznaczenia lekowrażliwości przy użyciu karty wskazuje wykrycie różnych mechanizmów, w tym ESBL (β-laktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym). Innymi przykładami są karty oznaczania lekowrażliwości dla rodzaju Enteroccocus i Staphylococcus. Karta zawiera wszystkie antybiotyki, na które należy oznaczać lekowrażliwość izolatów z obu rodzajów, stosowane zarówno w lecznictwie otwartym, jak i zamkniętym, dla pacjentów szpitalnych. Zastosowanie wysokich stężeń aminoglikozydów pozwala na wykrycie oporności szczepów  Enteroccocus na wszystkie antybiotyki tej klasy, a zastosowany w karcie zakres stężeń oksacyliny pozwala na wykrycie oporności na meticylinę zarówno u S. aureus, jak i gronkowców koagulazo-ujemnych.

System, na podstawie ustalonych wartości MIC (ang. Minimum inhibitiry concentration – minimalne stężenie hamujące wzrost drobnoustroju), dla każdego z testowanych antybiotyków dokonuje automatycznej interpretacji wrażliwości (S), oporności pośredniej (I) oraz oporności (R) danego izolatu na konkretny antybiotyk. Dane, którymi system się kieruje dokonując wszystkich analiz i interpretacji muszą być zgodne z obowiązującymi rozporządzeniami Europejskiego Komitetu ds. Oznaczania Lekowrażliwości EUCAST, dzięki czemu poświadczana jest wiarygodność i rzetelność prezentowanego wyniku.

Podsumowanie

Udoskonalane metody molekularne raz zautomatyzowane techniki biochemiczne stanowią idealną alternatywę dla tradycyjnych metod identyfikacji biochemicznej z zastosowaniem podłóż hodowlanych, nie tylko ze względu na koszt i wygodę, ale przede wszystkim na czas. Liczne badania, których celem jest zestawienie ze sobą metod tradycyjnej diagnostyki z metodami genetycznymi i proteomicznymi pokazują, że wiarygodność i precyzja identyfikacji za pomocą automatycznych lokuje się na poziomie zgodności analizy białek danego mikroorganizmu poprzez MALDI-TOF, a wartości MIC są zgodne w 99% z tymi uzyskiwanymi metodą manualną – seryjnych rozcieńczeń. Dane te potwierdzają użyteczność i precyzję zautomatyzowanych, bogatych w obszerną bazę danych systemów szybkiej identyfikacji biochemicznej mikroorganizmów.

Bibliografia

[1] Bobenchik A., Hindler J., Glitner C., Performance of Vitek 2 for Antimicrobial Susceptibility Testing of Staphylococcus spp. and Enterococcus spp. Journal of Clinical Microbiology, 2014; 52: p. 392–397.

[2] Fanjat N., Leclerq A., Comparison of the Phenotyping Methods ID 32E and VITEK 2 Compact GN with 16S rRNA Gene Sequencing for the Identification of Enterobacter sakazakii. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, June 2007, p. 2048–2050.

[3] Gherardi G., Angeletii S., Panniti M., Pompilio A., Comparative evaluation of the Vitek- 2 Compact and Phoenix systems for rapid identification and antibiotic susceptibility testing directly from blood cultures of Gram-negative and Gram-positive isolates. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 2012; 71: 20–31.

[4] Pincus D., Microbial identification using Biomerieux Vitek 2 Systems.

[5] Vitek 2 The Basics Manual, 2013.

X
Skip to content

Jeśli chcesz kontynuować oglądanie tej strony musisz zaakceptować użycie plików cookie. Więcej informacji

UWAGA: W portalu stosowane są pliki cookie.
Korzystanie z portalu bez zmiany ustawień dotyczących cookies oznacza, że będą one zamieszczane w Twoim urządzeniu (komputerze, telefonie), na co wyrażasz zgodę. W każdym czasie możesz dokonać zmiany ustawień dotyczących cookies. Więcej szczegółów znajdziesz na stronie Informacje o plikach cookies oraz Polityka prywatności.

Komunikat nawiązujący do nowelizacji Ustawy Prawo Telekomunikacyjne wchodzącej w życie dnia 22 marca 2013 roku.

Zamknij