Damian Sztucki

 

Niezależnie od wielkości i przeznaczenia laboratorium mikrobiologicznego, ze względu na specyfikę działalności istnieją pewne wymagania i zasady, których nie da się pominąć podczas organizacji jego pracy. Do najważniejszych można wymienić chociażby podstawę jaką stanowi odpowiedni projekt, poprzez wyposażenie, opracowanie odpowiednich metod, aż po doskonalenie i spełnianie pewnych standardów i wymogów. Ze względu na pracę z mikroorganizmami należy też wziąć pod uwagę ryzyko związane z tą odpowiedzialną praktyką i podjęcie kroków gwarantujących nie tylko odpowiednią jakość, ale przede wszystkim bezpieczeństwo.

 

 

Projekt laboratorium

Zgodnie z Rozporządzeniem Ministra Zdrowia z dnia 1 października 2008 roku pomieszczenia laboratoryjne muszą być zaprojektowane i zbudowane w odpowiedni sposób i wyposażone w sprzęt i urządzenia niezbędne do wykonywanych czynności.  Najważniejszą kwestią w laboratorium mikrobiologicznym jest eliminowanie zanieczyszczeń, czyli zachowanie jałowości. Rozmieszczenie i ilość pomieszczeń nie powinny być przypadkowe. Rozmiary poszczególnych pomieszczeń zależą najczęściej od ilości wykonywanych analiz i organizacji laboratorium. Typowe, składa się z głównych stanowisk badawczych oraz dodatkowych – pomocniczych, do których zaliczyć można korytarze, wejścia, szatnie, magazyny oraz pomieszczenia administracyjne. Pomieszczenia główne przeznaczone są do przyjmowania próbek, rozdziału materiału do badań oraz wykonywania czynności związanych z diagnostyką laboratoryjną. Pomieszczenia specjalne to najczęściej magazyny i pomieszczenia pomocnicze np. wagowe, czy chłodnicze.

Koncepcja projektu laboratorium mikrobiologicznego powinna być wykonana zgodnie z zasadą drogi jednokierunkowej tj. bez możliwości zawracania. Oznacza to, że czynności wykonywane w laboratorium będą rozdzielone w czasie i przestrzeni. Zapobiegać zanieczyszczeniom krzyżowym można również stosując odpowiednie środki techniczne i organizacyjne, takie jak: stosowanie śluz i wyciągów powietrznych oraz stosowanie zamkniętych systemów produkcyjnych. Każda osoba poruszająca się na terenie laboratorium powinna być wyposażona w środki ochrony osobistej, do których należy odzież ochronną (rękawiczki, fartuchy, maseczki) – uwarunkowane i dostoswane do wykonywanej czynności. Z tego względu powinna znajdować się tzw. śluza pomiędzy obszarem zewnętrznym a wewnętrznym pracowni, w której taka odzież i obuwie mogłyby być przechowywane. Aby uniknąć pomyłek i narażenia na zanieczyszczenie badanego materiału, czy odczynników Kierownictwo powinno opracować odpowiednie procedury dotyczące higieny osobistej na stanowisku pracy.

Meble laboratoryjne stanowią czynnik, który umożliwia komfort pracy, co przekłada się na jej organizację. Wybór odpowiednich mebli uzależniony jest przede wszystkim od: rodzaju wykonywanych czynności, wielkości personelu, wykorzystywanych urządzeń i ich rozmiaru. Meble w laboratorium powinny być wykonane z takich materiałów, które posiadają świadectwa dopuszczające je do eksploatacji w tego typu pomieszczeniach. Związane jest to przede wszystkim z faktem występowania wielu potencjalnie szkodliwych dla powierzchni odczynników: kwasów, zasad, środków dezynfekcyjnych. Informacje na temat mebli laboratoryjnych zostały określone przez Komitet Normalizacyjny w normie „PN-EN 14056:2003 Meble laboratoryjne. Zalecenia dotyczące projektowania i instalowania”.

Zgodnie z wymaganiami Normy ISO 7218 oraz zasadami GMP wyposażenie laboratoryjne musi być utrzymywane w czystości i dobrej sprawności. Przed każdym użyciem aparatury należy sprawdzać a następnie monitorować jej sprawność podczas pracy zgodnie z warunkami stosowania. W określonych odstępach czasu, lub w wyniku konieczności, wyposażenie należy wzorcować, tak aby zapewnić spójność pomiarową. Gwarantuje ona, że wynik pomiaru można powiązać z określonymi odniesieniami, na ogół z wzorcami państwowymi lub międzynarodowymi jednostki miary. Częstotliwość z jaką laboratorium podejmuje się wzorcowania i sprawdzeń urządzeń jest określana przez laboratorium na podstawie udokumentowanego.

Rozmieszczenie, kształt i konstrukcja pomieszczeń oraz lokalizacja, budowa i funkcjonalność urządzeń muszą uwzględniać konieczność ograniczenia do minimum ryzyka popełnienia błędu, a także umożliwiać efektywne czyszczenia, dezynfekcję i konserwację w celu uniknięcia zanieczyszczeń, a zwłaszcza krzyżowych. Bez wątpienia znakomitym ułatwieniem przy projektowaniu i ustalania konfiguracji pomieszczeń jest korzystanie z pomocy doradców znających specyfikę pracy laboratoryjnej i związanych z nią wymogów świadczących o wysokiej jakości prezentowanej pracy. To przede wszystkim dobrze zaprojektowana przestrzeń stanowi fundament bezpiecznej i higienicznej pracy.

Podłoża mikrobiologiczne

Jednym z podstawowych elementów funkcjonowania oraz zapewnienia jakości w mikrobiologii jest stosowanie właściwych i odpowiednio przygotowanych pożywek hodowlanych oraz zapewnienie stałości ich parametrów fizycznych, chemicznych i biochemicznych. Jakość podłoży mikrobiologicznych stosowanych do analiz przekłada się na ich efekt końcowy – wiarygodność uzyskanego wyniku. Jest ona uzależniona od kilku czynników, sprowadzających się do podstawowych etapów: przygotowania, obróbki, pakowania i magazynowania. Zachowanie optymalnych warunków wzrostowych dla poszukiwanych drobnoustrojów jest podstawową zasadą w analizie mikrobiologicznej.

Sytuacja z reguły jest łatwa w przypadku podłoży gotowe do użycia, które posiadają dokładnie określone przez producenta instrukcje postępowania w zakresie przechowywania i przydatności do użycia. Suche, sypkie pożywki dostarczane do laboratorium w formie proszku bądź granulatu nadające się do bezpośredniego uwodnienia znajdują się w szczelnie zamkniętych, nieprzezroczystych pojemnikach. Wyzwaniem mogą się okazywać podłoża przygotowywane i przechowywane przez laboratorium. W tym przypadku, w celu zapewnienia jakości danego podłoża każdy element składowy, czyli masa naważki, ilość dodanej wody, ilość dodawanego suplementu, data przygotowania, pH, warunki sterylizacji (jeśli wymagana) oraz wykonawca pożywki powinny zostać odnotowane w przygotowanym do tego celu dzienniku.

Podłoża mikrobiologiczne poddawane mogą być sterylizacji parą wodną pod ciśnieniem. Proces ten prowadzony jest w autoklawach wyposażonych w przyrządy do pomiaru i monitorowania temperatury oraz ciśnienia wewnątrz komory oraz elementy zabezpieczające. Ze względu na sterylizacje podłoży znajdujących się w butelkach/kolbach należy pamiętać o tym, żeby nie wypełniać ich ponad 90% ich pojemności. Powstałe nadciśnienie, zależne od ilości wypełnienia pojemnika może spowodować jego rozerwanie.

Pożywki hodowlane należy przechowywać w określonej temperaturze, w określonych warunkach i nie dłużej niż przewiduje to okres trwałości odpowiedni dla każdego produktu. Warunki przechowywania i data ważności każdego produktu są podane na etykietach lub ulotkach, ale poniższe ogólne zasady pomogą zapewnić, że będą one przechowywane w optymalnym środowisku. Przechowując produkty należy odnotować daty przydatności do spożycia na etykietach i używać produktów w kolejności ich numerów przygotowanych partii. Istotnymi aspektami podczas kontroli mikrobiologicznej przygotowanych i wysterylizowanych podłoży są: żyzność, czyli wpływ składników odżywczych na wzrost drobnoustrojów oraz selektywność, czyli promowanie wzrostu konkretnej grupy mikroorganizmów nad innymi.

Żyzność to cecha, która świadczy o właściwościach odżywczych danej pożywki wpływających na możliwość wzrostu drobnoustrojów. Pożywka charakteryzująca się odpowiednią żyznością to pożywka umożliwiająca szybki i intensywny wzrost drobnoustrojów. Ocenę żyzności podłoży zestalonych powinno się wykonywać stosując metody ilościowe oparte na współczynniku żyzności określającego stosunek liczby kolonii wyrosłych na sprawdzanej pożywce i liczby kolonii wyrosłych na pożywce referencyjnej. Z kolei selektywność podłoża to nic innego jak kontrolowanie zdolności wybiórczych podłoży. Proces ten ma na celu wykazanie prawidłowości działania określonych składników zawierających się w ich składzie chemicznym.

Mikroorganizmy

Praca z mikroorganizmami to często codzienność w laboratorium mikrobiologicznym, niezależnie od ukierunkowania jego działalności. Niekiedy potwierdzanie skuteczności podłoży mikrobiologicznych lub przeprowadzania testów obciążeniowych to jedyne momenty pracy z żywymi mikroorganizmami. W tym celu laboratoria często budują swoje zaplecza w postaci banków szczepów, które poddane odpowiednim zabiegom umożliwiają pracę z wykorzystaniem bakterii i grzybów w długim czasie.

Dobór metody magazynowania kultury szczepu odniesienia powinien mieć na wglądzie kilka istotnych aspektów, do których zalicza się: maksymalną przeżywalność komórek bakteryjnych/grzybiczych, minimalną ilość uszkodzonych komórek, zahamowanie procesów metabolicznych, ochronę przed spontanicznymi mutacjami, ochronę przed kontaminacją innymi drobnoustrojami, łatwość uaktywnienia kultury i transportu oraz zachowanie pierwotnych funkcji życiowych po rozmrożeniu. Do  najpowszechniej stosowanych technik należą: suszenie, mrożenie i pasażowanie.

Pasażowanie szczepów to nic innego, jak przeniesienie organizmów z żywej hodowli do świeżego podłoża, celem odmłodzenia i ponownego wzrostu po procesie inkubacji w odpowiednich warunkach. Każda forma kolejnej takiej hodowli traktowana jest jako kolejny pasaż. Proces ten może odbywać się z wykorzystaniem podłoża stałego, bądź płynnego. Jego dużą wadą jest ograniczona ilość pasaży możliwych do wykonania, ze względu na możliwe mutacje szczepów lub utratę żywotności komórek.

Długoterminowe, bo często wieloletnie magazynowanie szczepów umożliwia liofilizacja. Ten  dwuetapowy proces polega na oziębieniu i zamrożeniu zawiesiny komórkowej w temperaturze -70 ̊C, aby następnie wysuszeniu jej w warunkach próżniowych, gdzie dochodzi do sublimacji wody, czyli przejścia ze stanu stałego w gazowy, z pominięciem fazy ciekłej. W celu ochrony preparatu liofilizat powinien zawierać mniej niż 1% wody w swoim składzie, ponieważ niewielka ilość wody jest niezbędna do ochrony białek przed degradacją oraz utrzymania żywotności bakterii.

Najczęstszym rozwiązaniem stosowanym w laboratoriach jest mrożenie. Standardowo stosuje się w tym celu następujące poziomy temperatur: -20^oC, -80^oC, a nawet -196^oC. Ryzyko związane z tym procesem związane jest z fizycznym  niszczeniem komórek na skutek tworzenia kryształów lodu i wzrostu stężenia elektrolitu w czasie zamrażania i rozmrażania. Istnieją jednak sposoby zapobiegania takim mechanicznym rozpadom. W tym celu dodawane są tak zwane krioprotektanty, czyli substancje ochronne, których funkcją jest zabezpieczenie żywotności i aktywności komórek w czasie ich zamrażania, przechowywania i rozmrażania.

Dobra Praktyka Laboratoryjna

DPL (ang. GLP – Good Laboratory Practice) to system jakości oparty na wielu normach i procedurach gwarantujący odpowiednią jakość badań. Odnosi się w dużej mierze do procesu organizacji, planowania i monitorowania nieklinicznych badań substancji pod względem ich bezpieczeństwa i wpływu na zdrowie człowieka i środowiska. Ponadto określa ścisłe zasady badania oraz warunki, w jakich substancje badane powinny być przechowywane i planowane. Zasady DPL stosowane są w badaniach m.in.: bezpieczeństwa produktów leczniczych, środków ochrony roślin, produktów biobójczych, detergentów, kosmetyków oraz szeroko rozumianych chemikaliów przemysłowych. Podstawowym fundamentem i założeniem DPL jest zapewnienie wiarygodności uzyskiwanego wyniki badania.

Do kluczowych zasad wchodzących w zakres Dobrej Praktyki Laboratoryjnej należą: (1) organizacja jednostki badawczej i jej personel, (2) program zapewnienia jakości, (3) pomieszczenia i aparatura, (4) systemy badawcze, (5) materiały badane i odniesienia, (6) przeprowadzenie badań i sprawozdanie, oraz (7) archiwizacja dokumentacji. Te ogólne zagadnienia opisują warunki, jakie musi spełnić jednostka badawcza w kontekście zapewnienia jakości wykonywanych czynności na każdym etapie swojej działalności.

W ogólnym zarysie powyższe zasady odnoszą się do poniższych warunków. (1) Każda osoba wchodząca w skład personelu jednostki badawczej powinna mieć udokumentowane zapisy poświadczające jej kwalifikacje, szkolenia i doświadczenie. Zapewnienie takie, powinno przede wszystkim być poparte odpowiednią dokumentacją uprawniającą konkretne osoby do ponoszenia odpowiedzialności za prowadzone działania (badania). (2) Każda jednostka badawcza musi posiadać udokumentowany Program Zapewnienia Jakości, który stanowi gwarancję o prowadzeniu badań są zgodne z zasadami Dobrej Praktyki Laboratoryjnej. PZJ powinien być prowadzony przez osobę lub osoby, które będą odpowiedzialne bezpośrednio przed Zarządzającym, a także muszą zachować postronność i nie mogą być uczestnikami przeprowadzanych badań, których jakość weryfikują.

Gwarancją prawidłowego przeprowadzenia badania jest taki projekt przestrzeni laboratoryjnej, który zapewni odpowiedni stopień rozdzielenia i wykonywania różnych czynności (3). (4) W odniesieniu do systemów badawczych największe pole do regulacji zawierają systemy biologiczne wykorzystujące np. zwierzęta. W przypadku systemów fizycznych i chemicznych wyposażenie badawcze wykorzystywane do uzyskiwania danych musi posiadać parametry wystarczające do wykonania badania i jest odpowiednio rozmieszczone. (5) Jednostka badawcza musi określić sposób postępowania z badanymi materiałami od momentu i sposobu ich poboru, przez magazynowanie w optymalnych warunkach do wykorzystania i zutylizowania. (6) Każde pojedyncze badanie wykonywane w jednostce badawczej musi posiadać swój łatwo identyfikowalny numer, kod i nazwę. Próbki po zakończonej analizie muszą nadal być możliwe do szybkiego zidentyfikowania pod kątem ich pochodzenia. I ostatecznie (7) – jednostka badawcza zobowiązuje się do magazynowania przez okres co najmniej 10 lat zapisy i materiały w celu umożliwienia Inspektorowi do Spraw Substancji i Preparatów Chemicznych ich sprawdzenia spełnienia standardów.

 

Bibliografia

1. Wiktorek-Smagur A., Zasady dobrej praktyki laboratoryjnej. Chemia zdrowie środowisko, 4/2012.
2. Marczewska J., Mysłowska K., Dobra Praktyka Mikrobiologiczna w laboratorium wytwórni farmaceutycznej. LAB, 2015.
3. Marczewska J., Mysłowska K., Bezpieczeństwo pracy w laboratorium mikrobiologicznym. LAB, 2004.
4. Kustra J., Projektowanie laboratorium – wybór mebli. Laboratorium, 2012.
5. Kwiatek K., Nowe normatywne wytyczne w zakresie wytwarzania i stosowanie pożywek mikrobiologicznych. Życie Weterynaryjne, 2013
6. Mikołajczyk A., Stefaniuk E., Bosacka K., Właściwości i zastosowanie podłoży bakteriologicznych. Postępy Mikrobiologii, 2016.
7. Strzyż M., Wendt O., Zapewnienie jakości i kontrola jakości pożywek mikrobiologicznych w laboratorium medycznym. Diagnostyka laboratoryjna, 2012; 48.
8. Metody przechowywania drobnoustrojów. Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej SUM, 2015/16.
9. Stefaniuk E., Młodzińska E., Szczepy referencyjne do wewnętrznej kontroli jakości i zapewnienia spójności pomiarowej w laboratorium mikrobiologicznym, bioMerieux, 2012.