Przemysław Gogojewicz

Przeprowadzanie badań przesiewowych wymaga ustalania wartości odcięcia dla decyzji o zgodności z odpowiednimi najwyższymi dopuszczalnymi poziomami ustanowionymi albo też dla PCDD/F, albo dla sumy PCDD/F i dioksynopodobnych PCB. Dlatego też partia jest niezgodna z najwyższym dopuszczalnym poziomem określonym w rozporządzeniu (WE) nr 1881/2006, jeżeli średnia dwóch wyników uzyskanych metodą granicy oznaczalności (analiza powtórna ) z użyciem metody potwierdzającej, z uwzględnieniem niepewności rozszerzonej pomiaru, ponad wszelką wątpliwość przekracza najwyższy dopuszczalny poziom.

Metodologia pomiarowa

„Metodami przesiewowymi” zwykło się nazywać takie metody, które są wykorzystywane do wyboru próbek, w których to próbkach poziomy PCDD/F i dioksynopodobnych PCB przekraczają najwyższe dopuszczalne poziomy lub poziomy reagowania. Metody przesiewowe pozwalają na względnie tanie i szybkie oznaczanie dużej liczby próbek, zwiększając w ten sposób szansę wykrycia nowych przypadków wysokiego narażenia i związanego z tym ryzyka dla zdrowia konsumentów.

„Metodami potwierdzającymi”  zwykło się nazywać takie  metody, które dostarczają pełnych lub uzupełniających informacji, pozwalające na jednoznaczną identyfikację i ilościowe oznaczenie PCDD/F i dioksynopodobnych PCB na najwyższym dopuszczalnym poziomie lub w razie potrzeby na poziomie reagowania. W metodach tych wykorzystuje się chromatografię gazową z wysokorozdzielczą spektrometrią mas (GC-HRMS) lub chromatografię gazową z tandemową spektrometrią mas (GC-MS/MS).

 „Metodami bioanalitycznymi” zwykło się nazywać takie metody, które są oparte na zasadach biologicznych, np. metody biologiczne wykorzystujące hodowle komórkowe, metody biologiczne bazujące na badaniu receptorów lub testy immunologiczne. Metody bioanalityczne nie dają  wyników na poziomie kongenerów, a jedynie wskazanie poziomu TEQ wyrażonego w równoważnikach bioanalitycznych (BEQ), aby uwzględnić fakt, że nie wszystkie związki obecne w ekstrakcie próbki, które wywołują odpowiedź w badaniu, spełniają wszystkie wymogi zasady TEQ.

W celu obliczenia stężeń wyrażonych jako TEQ należy pomnożyć stężenia poszczególnych substancji w danej próbce przez ich odpowiednie współczynniki TEF, ustanowione przez Światową Organizację Zdrowia i wymienione w dodatku do niniejszego załącznika, a następnie zsumować je, co da łączne stężenie związków dioksynopodobnych wyrażone jako TEQ.

Metody przesiewowe i potwierdzające mogą być stosowane do kontroli określonej matrycy, jedynie jeżeli są one dostatecznie czułe, aby w sposób wiarygodny wykrywać poziomy odpowiadające najwyższemu dopuszczalnemu poziomowi lub poziomowi reagowania.

Wybór metod przesiewowych

Metody przesiewowe powinny zostać oparte na metodach bioanalitycznych lub metodach GC-MS. Wyniki które przekraczają wartość odcięcia, a które pochodzą z próbek zbadanych w celu kontroli zgodności z najwyższym dopuszczalnym poziomem, powinno się zweryfikować, wykonując ponownie pełną analizę oryginalnej próbki laboratoryjnej z wykorzystaniem metody potwierdzającej.

Zgodnie z przepisami rozporządzenia (WE) nr 882/2004 Parlamentu Europejskiego i Rady, laboratoria powinny być akredytowane przez uznany organ działający zgodnie z przewodnikiem ISO 58, aby zagwarantować, że stosują system zapewniania jakości analitycznej. Laboratoria muszą posiadać akredytację zgodną z normą EN ISO/IEC 17025.

Biegłość laboratoriów musi być udowodniona stałym uczestnictwem w międzylaboratoryjnych badaniach oznaczania PCDD/F i dioksynopodobnych PCB w odpowiednich matrycach żywności i zakresach stężeń.

Laboratoria stosujące przesiewowe metody analizy do rutynowej kontroli próbek powinny nawiązać ścisłą współpracę z laboratoriami stosującymi metody potwierdzające, zarówno w celach kontroli jakości, jak i potwierdzania wyników analitycznych podejrzanych próbek.

 

Uwaga

Każdą próbkę powinno się umieszczać  w czystym pojemniku wykonanym z chemicznie obojętnego materiału; pojemnik musi zapewniać odpowiednią ochronę przed zanieczyszczeniem, utratą analitów wskutek adsorpcji na wewnętrznej ściance pojemnika i przed uszkodzeniem w transporcie. Podejmowane są wszelkie niezbędne środki w celu zapobieżenia jakimkolwiek zmianom w składzie próbki, które mogłyby powstać w czasie transportu lub przechowywania.

Cele metod przesiewowych

Celem które dotyczą metod przesiewowych, jest wybór próbek o poziomach PCDD/F i dioksynopodobnych PCB przekraczających najwyższe dopuszczalne poziomy lub poziomy reagowania. Metody przesiewowe powinny pozwalać na względnie tanie i szybkie oznaczanie dużej liczby próbek, zwiększając w ten sposób szansę wykrycia nowych przypadków wysokiego narażenia i związanego z tym ryzyka dla zdrowia konsumentów. Ich stosowanie powinno mieć na celu unikanie wyników fałszywie ujemnych. Mogą obejmować metody bioanalityczne i metody GC/MS.

Metody przesiewowe opierają się na porównaniu wyniku analizy z wartością odcięcia, dając odpowiedź tak/ nie w kwestii ewentualnego przekroczenia najwyższego dopuszczalnego poziomu lub poziomów reagowania. Stężenie PCDD/F oraz sum PCDD/F i dioksynopodobnych PCB w próbkach podejrzanych o to, że są niezgodne z wymogami dotyczącymi najwyższego dopuszczalnego poziomu, należy oznaczyć lub potwierdzić przy zastosowaniu metody potwierdzającej. Ponadto metody przesiewowe mogą dać wskazania odnośnie do poziomów PCDD/F i dioksynopodobnych PCB obecnych w próbce.

W przypadku stosowania bioanalitycznych metod przesiewowych wynik wyrażony jest w równoważnikach bioanalitycznych (BEQ), a w przypadku stosowania fizykochemicznych metod GCMS jest on wyrażony w równoważnikach toksyczności (TEQ). Wyrażone liczbowo wyniki metod przesiewowych są odpowiednie do celów wykazania zgodności, podejrzenia niezgodności lub przekroczenia poziomów reagowania i dają wskazania odnośnie do zakresu poziomów w przypadku działań następczych z zastosowaniem metod potwierdzających. Nie są one odpowiednie do celów takich, jak: ocena poziomów tła, szacowanie pobrania, śledzenie tendencji poziomów w czasie lub ponowna ocena poziomów reagowania i najwyższych dopuszczalnych poziomów

Warto wiedzieć że

Na podstawie załącznika nr 1 do Rozporządzenia Komisji (UE) 2017/644  r. ustanawiając metody pobierania i analizy próbek do celów kontroli poziomów dioksyn, dioksynopodobnych polichlorowanych bifenyli i niedioksynopodobnych polichlorowanych bifenyli w niektórych środkach spożywczych, „Odzysk testu biologicznego”  to poziom BEQ obliczony z krzywej wzorcowej TCDD lub PCB 126, skorygowany o wynik dla próbki ślepej, a następnie podzielony przez poziom TEQ oznaczony metodą potwierdzającą. 

Jego celem jest korekta takich czynników, jak strata PCDD/PCDF i związków dioksynopodobnych podczas ekstrakcji i oczyszczania, związki współekstrahowane zwiększające lub zmniejszające odpowiedź (efekt agonistyczny lub antagonistyczny), jakość dopasowania krzywej lub różnice między wartościami TEF a REP.

„Odzysk testu biologicznego” jest obliczany na podstawie wyników badania odpowiednich próbek referencyjnych zawierających reprezentatywny profil kongenerów na poziomie zbliżonym do wartości najwyższego dopuszczalnego poziomu lub poziomu reagowania.

Metodologia bioanalityczna

Metodologia bioanalityczna są to metodologia oparta na zasadach biologicznych, np. metody biologiczne wykorzystujące hodowle komórkowe, metody biologiczne bazujące na badaniu receptorów lub testy immunologiczne.  W tym celu obliczony poziom BEQ jest porównywany z wartością odcięcia.  Próbki poniżej wartości odcięcia są uznawane za ujemne, a próbki równe wartości odcięcia lub ją przekraczające — za podejrzewane o bycie dodatnimi i wymagające analizy metodą potwierdzającą. W praktyce poziom BEQ odpowiadający dwóm trzecim najwyższego dopuszczalnego poziomu może posłużyć jako wartość odcięcia, pod warunkiem że zapewnione są: wskaźnik liczby wyników fałszywie ujemnych poniżej 5 % i dopuszczalny wskaźnik wyników fałszywie dodatnich. Przy odrębnych najwyższych dopuszczalnych poziomach dla PCDD/F oraz dla sumy PCDD/F i dioksynopodobnych PCB sprawdzanie zgodności próbek bez frakcjonowania wymaga odpowiednich wartości odcięcia testu biologicznego dla PCDD/F. Jako wartość odcięcia do sprawdzenia próbek przekraczających poziomy reagowania wystarczyłby odpowiedni odsetek danego poziomu reagowania. Jeżeli indykatywny poziom jest wyrażony w BEQ, wyniki z próbki muszą być podane w zakresie roboczym, przekraczającym poziom zgłaszania.

Metodologia pobierania próbek –  wymagania które dotyczą laboratoriów

Zgodnie z przepisami rozporządzenia (WE) nr 882/2004 laboratoria muszą być akredytowane przez uznany organ działający zgodnie z przewodnikiem ISO 58, aby zagwarantować, że stosują system zapewniania jakości analitycznej. Laboratoria muszą posiadać akredytację zgodną z normą EN ISO/IEC 17025. W stosownych przypadkach korzysta się z zasad opisanych w dokumencie „Technical Guidelines for the estimation of measurement uncertainty and limits of quantification for PCDD/F and PCB analysis” ( 1 ).

Biegłość która dotyczy laboratoriów musi być udowodniona stałym uczestnictwem w międzylaboratoryjnych badaniach oznaczania PCDD/F i dioksynopodobnych PCB w odpowiednich matrycach żywności i zakresach stężeń. Dlatego też laboratoria stosujące przesiewowe metody analizy do rutynowej kontroli próbek nawiązują ścisłą współpracę z laboratoriami stosującymi metody potwierdzające, zarówno w celach kontroli jakości, jak i potwierdzania wyników analitycznych podejrzanych próbek.

 

Podstawowe wymagania, które dotyczą procedur analitycznych dla dioksyn (PCDD/F) i dioksynopodobnych PCB

Niski zakres roboczy, granica oznaczalności

Jak wynika z zapisów załącznika nr III do rozporządzenia, w przypadku PCDD/F wykrywalne ilości muszą znajdować się na górnym poziomie femtogramów (10– 15 g) z uwagi na ekstremalną toksyczność niektórych z tych związków. W przypadku większości kongenerów PCB granica oznaczalności rzędu nanogramów (10– 9 g) jest już wystarczająca. Jednakże w przypadku oznaczania bardziej toksycznych kongenerów dioksynopodobnych PCB (w szczególności kongenerów podstawionych w pozycji non-orto) dolna granica zakresu roboczego musi osiągnąć niskie poziomy rzędu pikogramów (10– 12 g).

 

Wysoka selektywność, czyli swoistość

Jak wynika z praktyki konieczne jest rozróżnienie PCDD/F i dioksynopodobnych PCB od wielu innych współekstrahowanych i ewentualnie interferujących związków występujących w stężeniach do kilku razy wyższych od stężeń analitów będących przedmiotem zainteresowania.

W przypadku metod GC-MS (chromatografia gazowa/ spektometria masowa) konieczne jest rozróżnienie między różnymi kongenerami, np. między kongenerami toksycznymi (np. siedemnaście PCDD/F z atomami chloru w pozycjach 2,3,7,8 oraz dwanaście dioksynopodobnych PCB) a pozostałymi kongenerami.

Metody bioanalityczne powinny być w stanie wykrywać docelowe związki jako sumę PCDD/F lub dioksynopodobnych PCB. Oczyszczanie próbki ma na celu usunięcie związków dających wyniki fałszywie ujemne lub związków, które mogą zmniejszać odpowiedź, powodując wyniki fałszywie ujemne.

 

 Wysoka dokładność czyli poprawność i precyzja, odzysk testu biologicznego

Jak wskazuje rozporządzenie, w przypadku metod GC-MS oznaczenie musi dostarczyć wiarygodnych szacunków rzeczywistego stężenia w próbce. Wysoka dokładność (dokładność pomiaru: stopień zgodności między wynikiem pomiaru a rzeczywistą lub domniemaną wartością mierzoną) jest konieczna, aby uniknąć odrzucenia wyniku analizy próbki z powodu słabej wiarygodności oznaczonego poziomu TEQ. Dokładność jest wyrażona jako poprawność (różnica między średnią wartością mierzoną w odniesieniu do analitu w certyfikowanym materiale a jego certyfikowaną wartością, wyrażona jako odsetek tej wartości) i precyzja (RSDR – względne odchylenie standardowe obliczone na podstawie wyników osiągniętych w warunkach odtwarzalności).

W przypadku metod bioanalitycznych należy oznaczyć odzysk testu biologicznego.

 

Walidacja która dotyczy zakresu najwyższego dopuszczalnego poziomu, oraz środków ogólnej kontroli jakości

Warto wiedzieć że, laboratoria muszą wykazać zdolność metody w zakresie najwyższego dopuszczalnego poziomu, np. 0,5-, 1- i 2-krotność najwyższego dopuszczalnego poziomu przy akceptowalnej wartości współczynnika zmienności obliczonego dla wielokrotnych powtórzeń analizy podczas procedury walidacji lub rutynowej analizy.

W ramach wewnątrzlaboratoryjnej kontroli jakości należy regularnie przeprowadzać ślepe próby i badania z wykorzystaniem próby wzbogaconej lub analizy próbek kontrolnych (zwłaszcza certyfikowanych materiałów referencyjnych, jeżeli materiały takie są dostępne). Wykresy kontroli jakości dla ślepych prób, badań z wykorzystaniem próby wzbogaconej lub analiz próbek kontrolnych należy rejestrować i kontrolować, aby upewnić się, że zdolność analityczna jest zgodna z wymaganiami.

 

Granica które dotyczą oznaczalności

Jak wskazuje załącznik nr III do rozporządzenia, w przypadku bioanalitycznej metody przesiewowej ustanowienie granicy oznaczalności (LOQ) nie jest niezbędnym wymaganiem, ale należy dowieść, że metoda pozwala na rozróżnienie między ślepą próbą a wartością odcięcia. Podając poziom BEQ, należy ustalić poziom zgłaszania, aby uwzględnić próbki wykazujące odpowiedź poniżej tego poziomu.

 Należy zatem wykazać, że poziom zgłaszania jest różny od ślepych próbek proceduralnych co najmniej o współczynnik 3 przy odpowiedzi poniżej zakresu roboczego. W związku z powyższym należy go obliczyć z próbek zawierających związki docelowe w granicach wymaganego poziomu minimalnego, a nie ze stosunku S/N lub ze ślepej próby.

 

Uwaga

Granica oznaczalności (LOQ) dla metody potwierdzającej wynosi ok. jednej piątej najwyższego dopuszczalnego poziomu.

 

Kryteria analityczne

Dla uzyskania wiarygodnych wyników metodą potwierdzającą lub przesiewową należy spełnić poniższe kryteria w zakresie najwyższego dopuszczalnego poziomu dla wartości TEQ w odniesieniu do wartości BEQ, niezależnie do tego, czy są oznaczane jako całkowita wartość TEQ lub BEQ (jako suma PCDD/F i dioksynopodobnych PCB), czy odrębnie dla PCDD/F i dioksynopodobnych PCB.

	Bioanalityczna lub fizykochemiczna metoda przesiewowa	Metody potwierdzające
Wskaźnik liczby wyników fałszywie ujemnych (*)	< 5 %
Poprawność		– 20 % do + 20 %
Powtarzalność (RSDr)	< 20 %
Precyzja pośrednia (RSDR)	< 25 %	< 15 %
(*) W odniesieniu do najwyższych dopuszczalnych poziomów.

 

 Szczegółowe wymagania, które dotyczą metod przesiewowych

Na podstawie rozporządzenia, w metodach przesiewowych można stosować zarówno metody GC-MS, jak i metody bioanalityczne. W przypadku metod GC-MS zastosowanie mają wymagania ustanowione w pkt 6. W przypadku metod bioanalitycznych opierających się na oznaczeniach komórkowych zastosowanie mają szczegółowe wymagania ustanowione w pkt 7.

Laboratoria stosujące metody przesiewowe do rutynowej kontroli próbek powinny nawiązać ścisłą współpracę z laboratoriami stosującymi metodę potwierdzającą.

Podczas rutynowej analizy wymagana jest weryfikacja zdolności metody przesiewowej w drodze kontroli jakości analizy i walidacji metody podczas analizy. Należy prowadzić ciągły program kontroli wyników ujemnych.

Należy wiec sprawdzać, czy nie zachodzi ewentualne tłumienie odpowiedzi komórek i cytotoksyczność.

 

Uwaga

20% ekstraktów próbek należy analizować rutynowo metodą przesiewową bez TCDD oraz z TCDD dodanym zgodnie z najwyższym dopuszczalnym poziomem lub poziomem reagowania, aby sprawdzić, czy odpowiedź jest ewentualnie tłumiona przez substancje interferujące obecne w ekstrakcie próbki.

 

Zmierzone stężenie próbki wzbogaconej jest porównywane do sumy stężenia ekstraktu próbki niewzbogaconej i stężenia wzbogacenia. Jeżeli zmierzone stężenie jest o ponad 25 % niższe niż obliczone (zsumowane) stężenie, wskazuje to na ewentualne tłumienie sygnału, a odpowiednia próbka musi zostać przekazana do analizy potwierdzającej. Wyniki należy monitorować na wykresach kontroli jakości.

 

Kontrola jakości dotycząca próbek ujemnych

Zgodnie z rozporządzeniem należy potwierdzić ok. 2–10 % próbek ujemnych, zależnie od matrycy próbki i doświadczenia laboratorium.

Oznaczenie wskaźnika liczby wyników fałszywie ujemnych z danych kontroli jakości

Należy oznaczyć wskaźnik liczby wyników fałszywie ujemnych z badań przesiewowych próbek poniżej i powyżej najwyższego dopuszczalnego poziomu lub poziomu reagowania. Rzeczywisty wskaźnik liczby wyników fałszywie ujemnych nie może przekraczać 5%.

Po uzyskaniu z kontroli jakości próbek ujemnych co najmniej 20 potwierdzonych wyników na matrycę/ grupę matryc należy na podstawie tej bazy danych wyciągnąć wnioski dotyczące wskaźnika liczby wyników fałszywie ujemnych.

 

Uwaga

Do tych 20 wyników w celu oceny wskaźnika liczby wyników fałszywie ujemnych można także włączyć wyniki uzyskane na próbkach analizowanych w badaniach biegłości lub podczas incydentów wystąpienia zanieczyszczenia, obejmujące zakres stężeń do np. 2-krotności najwyższego dopuszczalnego stężenia.

 

Próbki muszą obejmować najczęstsze profile kongenerów, reprezentujące różne źródła.

Chociaż badania przesiewowe mają na celu wykrywanie próbek przekraczających poziom reagowania, kryterium określania wskaźnika liczby wyników fałszywie ujemnych jest najwyższy dopuszczalny poziom, przy uwzględnieniu niepewności rozszerzonej pomiaru metody potwierdzającej.

Potencjalnie dodatnie wyniki z badania przesiewowego weryfikuje się zawsze pełną ponowną analizą pierwotnej próbki przy zastosowaniu metody potwierdzającej. Próbki te mogą być też zastosowane do oceny wskaźnika wyników fałszywie dodatnich. W przypadku metod przesiewowych wskaźnik wyników fałszywie dodatnich to odsetek wyników, które potwierdzono w drodze analizy potwierdzającej jako ujemne, a w przypadku których we wcześniejszych badaniach przesiewowych stwierdzono podejrzenie, że są dodatnie. Ocena korzyści metody przesiewowej musi jednak być oparta na porównaniu próbek fałszywie dodatnich z całkowitą liczbą sprawdzonych próbek. Wskaźnik ten musi być na tyle niski, aby stosowanie narzędzia przesiewowego było korzystne.

 

Uwaga

Metody bioanalityczne przynajmniej w warunkach walidacji muszą dostarczyć wiarygodnego wskazania poziomu TEQ, obliczonego i wyrażonego jako BEQ.

Także w przypadku metod bioanalitycznych przeprowadzonych w warunkach powtarzalności wewnątrzlaboratoryjny RSDr byłby zwykle niższy niż odtwarzalność RSDR.

 

Podstawa prawna:

Rozporządzenie Komisji (UE) 2017/644 z dnia 5 kwietnia 2017 r. ustanawiające metody pobierania i analizy próbek do celów kontroli poziomów dioksyn, dioksynopodobnych polichlorowanych bifenyli i niedioksynopodobnych polichlorowanych bifenyli w niektórych środkach spożywczych oraz uchylające rozporządzenie (UE) nr 589/2014 z dnia 5 kwietnia 2017 r. ( t. j. Dz. Urz.UE.L Nr 92, str. 9)