Białka stanowią podstawowy składnik pokarmowy, niezbędny w codziennej diecie każdego człowieka. Składają się z aminokwasów, a uwzględniając skład aminokwasowy białek, można je podzielić na pełnowartościowe białka i niepełnowartościowego. Białka pełnowartościowe zawierają nie tylko wszystkie egzogenne aminokwasy (czyli takie, których organizm nie może samodzielnie syntetyzować, wobec czego muszą być dostarczane w pożywieniu), ale również ich zawartość jest w odpowiedniej ilości, aby zaspokoić wszystkie potrzeby organizmu. Białka niepełnowartościowe są z kolei pozbawione co najmniej jednego aminokwasu egzogennego. Różnorodność białek wynika więc ze składu aminokwasów (zestawienie aminokwasów z podziałem na egzogenne oraz endogenne usystematyzowano w Tabeli 1), a także ze sposobu uszeregowania reszt różnych aminokwasów w cząsteczce.

 

 

 

Tabela 1. Zestawienie aminokwasów wchodzących w skład białek,

z podziałem na aminokwasy egzogenne oraz endogenne.

 

aminokwasy egzogenne	aminokwasy endogenne
walina	glicyna
leucyna	prolina
izoleucyna	alanina
fenyloalanina	tyrozyna
histydyna	cysteina
tryptofan	cystyna
metionina	seryna
treonina	kwas asparaginowy
arginina	kwas glutaminowy
lizyna	glutamina
	asparagina

 

 

Właściwości fizyczne, chemiczne oraz biologiczne poszczególnych białek są ściśle związane z ich strukturą, ponieważ aminokwasy zawierają różne grupy funkcyjne (kwasowe, zasadowe, pierścienie aromatyczne, grupy alkoholowe, atomy siarki itd.). Białka na ogół są rozpuszczalne w wodzie, a także posiadają zdolność wiązania cząsteczek wody (hydratacja).

 

Właściwości funkcjonalne białek, które wynikają z ich oddziaływań z wodą, innymi białkami, cukrami i tłuszczami w produktach spożywczych, mają wpływ również na określone cechy sensoryczne żywności [1].

 

Z uwagi na naturę wszystkich pokarmów, również zawartości białek w różnych środkach spożywczych jest różna, zależna od charakteru danego produktu spożywczego. Z reguły zawartość białka w owocach jest niska, poniżej 1%, w zbożach oscyluje pomiędzy 7 – 22%, a w przetworach mlecznych wynosi około 20%. Najwięcej białka zawierają preparaty wytwarzane z surowców roślinnych, takich jak soja lub rzepak, a także ekstrakty drożdżowe, w których zawartość białka wynosi 60 – 90%.

 

Z punktu widzenia wartości odżywczej oraz konieczności zapewnienia odpowiedniej ilości białka w codziennej diecie konsumentów, zawartość białka jest parametrem, który musi być oznaczony z odpowiednią dokładnością i precyzją. Służy temu szereg metodyk analitycznych, wykorzystywanych w laboratoriach całego świata, opartych na zasadzie pomiarów pośrednich oraz pomiarów bezpośrednich.

 

Metodami bezpośrednimi, które są najczęściej wykorzystywane celem oznaczenia zawartości białka są metoda immunoenzymatyczna, metoda biuretowa, metoda Lowry’ego, a także metoda formolowa oraz metodyki oparte na wykorzystaniu techniki spektrofotometrii w zakresie nadfioletu oraz oparte na zjawisku selektywnego pochłaniania promieniowania w zakresie podczerwieni [2-6].

 

Metody pośrednie, do których należy metoda Kjeldahla oraz metoda Dumasa, polegają na określeniu zawartości azotu oraz – przy zastosowaniu odpowiednich współczynników przeliczeniowych – przeliczeniu zawartości oznaczonego azotu na zawartość białka [7]. Przeciętna zawartość azotu w białkach wynosi około 16%, stąd też najbardziej powszechnym współczynnikiem przeliczeniowym jest wartość 6,25. Taka wartość została również wskazana w Rozporządzeniu 1169/2011, dotyczącym wartości odżywczej produktów spożywczych [8]. Jednakże z uwagi na fakt, że białka poszczególnych grup produktów spożywczych różnią się między sobą składem jakościowym oraz ilościowym białek, odmienna jest także zawarta w nich ilość azotu. Współczynniki przeliczeniowe mają więc różną wielkość, w zależności od rodzaju żywności, a ich przykładowe wartości, bazując na podstawie dostępnych danych literaturowych, zestawiono w Tabeli 2.

 

 

Tabela 2. Przykładowe wartości współczynników przeliczeniowych wykorzystywanych

celem przeliczenia zawartości oznaczonego azotu na zawartość białka w poszczególnych

produktach żywnościowych [9-11].

 

produkt spożywczy	współczynnik przeliczeniowy
produkty pochodzenia zwierzęcego
jaja (całe)	6,25
białko jaja	6,32
mleko i produkty mleczne	6,38
mięso	6,25
ryby	6,25
żelatyna	5,55
kazeina	6,40
produkty pochodzenia roślinnego
pszenica – ziarno	5,83
pszenica – otręby	6,31
ryż i mąka ryżowa	5,95
żyto i mąka żytnia	5,83
jęczmień i mąka jęczmienna	5,88
owies	5,50
pszenżyto	5,78
proso	6,31
kukurydza	6,25
fasola	6,25
soja	5,71
migdały	5,18
orzechy brazylijskie	5,46
orzechy ziemne	5,46
pozostałe orzechy	5,30
słonecznik	5,30

 

 

 

Jak już wspomniano powyżej, metody Kjeldahla oraz Dumasa należą do pośrednich metod oznaczania białka w produktach spożywczych. Są też jednymi z najpopularniejszych technik, stosowanych powszechnie w laboratoriach analitycznych.

 

Zasady obu metodyk nie są najnowsze, ponieważ metodę Dumasa opracował w roku 1826 Jean Baptiste Dumas, natomiast metodę Kjeldahla opracował w roku 1883 Johan Kjeldahl. Jak można zauważyć, obie techniki swoje nazwy zawdzięczają swoim wynalazcom, a metoda Dumasa jest starsza niż metoda Kjeldahla.

 

W dużym stopniu ogólności, metoda Kjeldahla polega na mineralizacji próbki w obecności odpowiedniego katalizatora we wrzącej mieszaninie kwasu siarkowego, zalkalizowaniu roztworu celem uwolnienia amoniaku, destylacji uwolnionego amoniaku z parą wodną, a następnie miareczkowaniu uwolnionego amoniaku. Proces prowadzony jest więc w trzech etapach (schematycznie przedstawionych na rysunku 1), a z uwagi na stosowane odczynniki oraz szkło laboratoryjne, narażone na działanie wysokich temperatur i agresywnych odczynników – wymaga zachowania ostrożności oraz zasad bezpieczeństwa pracy. Metody Kjeldahla nie można więc zaliczyć do metod szybkich, proekologicznych lub też obojętnych dla środowiska.

Rysunek 1. Schemat metody Kjeldahla, ramką zaznaczono trzy etapy procesu metody Kjeldahla. [należy kliknąć w celu powiększenia]

 

Popularność i powszechność wykorzystania metody Kjeldahla jest związana z faktem wskazania jej, jako metody odwoławczej w wielu wytycznych normalizacyjnych i legislacyjnych. Również przywołane powyżej Rozporządzenie 1169/2011 [8] przywołuje metodę Kjeldahla jako podstawową technikę oznaczania zawartości białka w produktach spożywczych.

 

Metoda Dumasa polega na spalaniu próbki w ~800-1000°C – w tej temperaturze, w atmosferze tlenu, azot zawarty w związkach przetwarzany jest na tlenek azotu, a następnie na azot cząsteczkowy. W procesie spalania i utleniania wszystkie tlenki azotu są redukowane do azotu cząsteczkowego i w strumieniu gazu nośnego są transportowane do celki detektora. Można powiedzieć, że jest to analiza jednoetapowa, gdyż wszystkie etapy odbywają się w sposób automatyczny, niezależny od operatora (Rysunek 2).

 

Sama analiza trwa kilka minut, a jej największą wadą jest wysoki koszt początkowy, związany z zakupem odpowiedniego aparatu. Metoda Dumasa jest zaliczana do technik proekologicznych, gdyż wymaga stosowania jedynie nieagresywnej i nietoksycznej metody utleniania, podstawowych substancji redukujących oraz odpowiednich gazów, stosowanych jako medium nośne. Zdecydowaną zaletą metody Dumasa jest możliwości całkowitego zautomatyzowania procesu pomiarowego, a dzięki możliwości wyposażenia układu w automatyczny podajnik próbek – nie wymaga również nadzoru ze strony personelu. Stosowanie metody Dumasa nie wymaga dużego zaangażowania personelu, gdyż poza homogenizacją i przygotowaniem odważki próbki przeznaczonej do badania, obsługa urządzenia z reguły sprowadza się jedynie do podstawowych czynności konserwacyjnych.

 

W ostatnich latach coraz większą uwagę zwraca możliwość stosowania technik analitycznych, które zapewniać będą bezpieczeństwo pracowników oraz nie będą mieć negatywnego wpływu na środowisko. Pod tym względem metoda Dumasa ma zdecydowaną przewagę. Porównując wyniki uzyskiwane z wykorzystaniem obu technik podkreślić należy, że wysokotemperaturowy rozkład metodą Dumasa zapewnia całkowite odtworzenie zawartości azotu (tzw. azotu całkowitego), natomiast stosowanie metody Kjeldahla – jest zależne od procesów mineralizacji, a tym samym może być powodem wahań uzyskiwanych wyników. Jednakże prowadzone prace potwierdzają, że dla produktów rolno-spożywczych, wyniki uzyskiwane za pomocą obu technik są porównywalne [12-16].

 

Również w ostatnich latach coraz więcej metodyk, związanych z wykorzystaniem metody Dumasa do oznaczania zawartości azotu lub białka w różnego rodzaju produktach spożywczych, zostało oficjalnie opublikowanych w formie norm krajowych lub międzynarodowych. Przykładem może być:

 

• szereg norm opublikowanych przez AOAC (Association of Official Agricultural Chemists) – np.
  • AOAC 992.15 dotycząca oznaczania zawartości białka z wykorzystaniem metody Dumasa w mięsie i produktach mięsnych [17],
  • AOAC 992.23 (białko w ziarnach zbóż i nasionach roślin oleistych) [18],
  • AOAC 997.09 (azot w piwie i brzeczce) [19],
• metody opublikowane przez AOCS (American Oil Chemists’ Society) dotyczące zawartości białka w soi i mączce sojowej [20], czy też produktach ubocznych z nasion oleistych [21]
• normy z serii ISO:
  • PN-EN ISO 14891:2004 – dotycząca oznaczania zawartości azotu w mleku i przetworach mlecznych [22]
  • PN-EN ISO 16634-1:2008 – dotycząca oznaczania zawartości azotu w nasionach roślin oleistych i paszach [10]
  • PN-EN ISO 16634-2:2016-08 – dotycząca oznaczania zawartości azotu w ziarnach zbóż, nasionach roślin strączkowych i przetworach zbożowych [11].

 

Podsumowując – zalety metody Dumasa (prostota operacji, bezpieczeństwo analityków, szybki czas oznaczenia oraz praktycznie brak odpadów), a także uniezależnienie rezultatów oznaczenia od procesu mineralizacji mokrej – pozwalają na uzyskiwanie wyników rzetelnych i porównywalnych do wyników uzyskiwanych z wykorzystaniem metody Kjeldahla. Te dwie techniki można więc uznać za równoważne i stosować rutynowo w laboratoriach analitycznych.

 

Literatura

 

[1] Florkowski T., Florkowska A., Kur A., Pisula A., Porównanie wpływu dodatku białka kolagenowego i sojowego na jakość restrukturowanych szynek parzonych wyprodukowanych z mięsa PSE, ŻYWNOŚĆ. Nauka. Technologia. Jakość, 2013, 4 (89), 90 – 99

 

[2] Sapan C.V., Lundblad R.L., Price N.C., Colorimetric protein assay techniques, Biotechnol Appl Biochem. 1999, 29, 99–108

 

[3] Kashyap M.K., Hynd B.A., Robinson K., A rapid and simple method for measurement of total protein in very low density lipoproteins by the Lowry assay, J Lipid Res, 1980, 2, 1, 491–495

 

[4] Enechi O.C., Nwabueze C.E., A new colorimetric method for the determination of proteins, Adv Biol Res, 2013, 7, 5, 159–162

 

[5] Adewale I.O., Akinseye O.R., Odutayo A.I., Protein quantitation using dyes obtained from plant materials, Adv Biosci Biotechnol, 2012, 3, 227–230

 

[6] Wolska J., Janda K., Gutowska K., Spektrofotometryczne oznaczanie zawartości białka w monocytach/ makrofagach THP-1 – opis metody, Pom J Life Sci, 2015, 61, 1, 77–80

 

[7] Myszka K., Kamińska B., Fraś A., Ploch M., Boros D., Metoda Dumasa alternatywną metodą oznaczania białka w produktach roślinnych – badania porównawcze z metodą Kjeldahla. Biuletyn Instytutu Hodowli i Aklimatyzacji Roślin. 2011, 260/261, 155–161

 

[8] Rozporządzenie Parlamentu Europejskiego i Rady (UE) nr 1169/2011 z dnia 25 października 2011 r. w sprawie przekazywania konsumentom informacji na temat żywności, zmiany rozporządzeń Parlamentu Europejskiego i Rady (WE) nr 1924/2006 i (WE)nr 1925/2006 oraz uchylenia dyrektywy Komisji 87/250/EWG, dyrektywy Rady 90/496/EWG, dyrektywy Komisji 1999/10/WE, dyrektywy 2000/13/WE Parlamentu Europejskiego i Rady, dyrektyw Komisji 2002/67/WE i 2008/5/WE oraz rozporządzenia Komisji (WE) nr 608/2004, OJ L 304, 22.11.2011, p. 18–63, z późniejszymi zmianami

 

[9] Greenfield H., Southgate D.A.T., Food Composition Data. Production, Management and Use. 2nd ed. FAO, Rome 2003

 

[10] PN-EN ISO 16634-1:2008 Produkty żywnościowe. Oznaczanie całkowitej zawartości azotu przez spalanie zgodnie z zasadą Dumas i obliczanie zawartości białka ogólnego. Część 1: Nasiona roślin oleistych i pasze

 

[11] PN-EN ISO 16634-2:2016-08 Produkty żywnościowe. Oznaczanie całkowitej zawartości azotu przez spalanie zgodnie z zasadą Dumas i obliczanie zawartości białka ogólnego. Część 2: Ziarno zbóż, nasiona roślin strączkowych i przetwory zbożowe

 

[12] Florkiewicz A., Cieślik E., Filipiak-Florkiewicz A., Oznaczanie zawartości azotu całkowitego w żywności – porównanie metody Kiejdahla i Dumasa, Bromat. Chem. Toksykol, 2010, 4, 523 – 528

 

[13] Etheridge R.D., Pesti G.M., Foster E.H., A comparison of nitrogen values obtained utilizing the Kjeldahl nitrogen and Dumas combustion methodologies (Leco CNS 2000) on samples typical of an animal nutrition analytical laboratory, Animal Feed Sci Tech, 1998, 73, 21-28

 

[14] Watson M.E., Galliher T.L., Comparison of Dumas and Kjeldahl methods with automatic analyzers on agricultural samples under routine rapid analysis conditions, Communications in Soil Science and Plant Analysis, 2001, 32:13-14, 2007-2019

 

[15] Thompson M., Owen L., Wilkinson K., Wood R., Damant A., A comparison of the Kjeldahl and Dumas methods for the determination of protein in foods, using data from a proficiency testing scheme, Analyst, 2002, 127, 1666-1668

 

[16] Jung S., Rickert D.A., Deak N.A., Aldin E.D., Johnson L.A., Murphy P.A., Comparison of Kjeldahl and Dumas methods for determining protein contents of soybean products. J Amer Oil Chem Soc, 2003, 80, 1169

 

[17] AOAC 992.15-1992(1996) Crude Protein in Meat and Meat Products Including Pet Foods (Combustion Method)

 

[18] AOAC 992.23-1992(1998) Crude protein in cereal grains and oilseeds. Generic combustion method

 

[19] AOAC 997.09-2008 Nitrogen in beer, Wort, and brewing grains protein (total) by calculation. Combustion method

 

[20] AOCS Official Method Ba 4f-00, Combustion Method for Crude Protein in Soybean Meal

 

[21] AOCS Ba 4e-93 Generic Combustion Method for Determination of Crude Protein (Oilseed byproducts)

 

[22] PN-EN ISO 14891:2004 Mleko i przetwory mleczne. Oznaczanie zawartości azotu. Metoda rutynowa z zastosowaniem spalania według zasady Dumasa

 

 

*i2 Analytical Limited Sp. z o.o. Oddział w Polsce, ul. Pionierów 39, 41-711 Ruda Śląska