Autor: Paula Ślipek, Michał Rok

 

Kriobiologia, krioprezerwacja, witryfikacja – zastosowanie i zapotrzebowanie

 

Krioprezerwacja jest procesem polegającym na przechowywaniu zamrożonego materiału biologicznego w ciekłym azocie w temperaturze między -79^°C a -196^°C,  pozwalającej na ustanie procesów metabolicznych. Dzięki temu możliwe jest bankowanie tkanek, komórek, oocytów, komórek macierzystych, embrionów, nasienia ludzkiego i zwierzęcego, a nawet nasion roślin. W zależności od potrzeb i rodzaju próbek przechowywanie ich odbywa się albo bezpośrednio w ciekłym azocie albo w jego oparach. Samo zamrażanie musi być na tyle szybkie by nie doszło do nadmiernego obkurczenia komórek i na tyle wolne by nie dopuścić do ich lizy. Witryfikacja, jedna z technik mrożenia  zwana zeszkleniem, polega na błyskawicznym zanurzeniu preparatu w ciekłym azocie, dzięki czemu nie dochodzi do zamiany roztworu komórek w kryształy lodu, a w amorficzne ciało stałe podobne do szkła.

Wszystko zależy od tego jakiego typu materiał ma być przechowywany. Komórki jednojądrzaste (izolowane z krwi) przechowuje się w temperaturze -190^°C w oparach ciekłego azotu, surowicę i DNA w temperaturze -80^°C w zamrażarkach kriogenicznych, natomiast oocyty, komórki macierzyste czy nasiona w temperaturze -196^°C bezpośrednio w ciekłym azocie. W przypadku białek natywnych postępuje się tak jak z hodowlami komórkowymi – lizat zanurza się w odpowiednim buforze a następnie w ciekłym azocie i przechowuje w minimum – 70^°C. W przypadku ekstraktów komórkowych istnieje wiele sposobów na ich przechowywanie z uwagi na to, że nie muszą być one utrzymywane przy życiu. Zasoby biologiczne przechowywane są w różnego typu zbiornikach kriogenicznych, zwanych często dewarami, lub w specjalistycznych zamrażarkach kriogenicznych. Zgromadzony w ten sposób materiał biologiczny wykorzystywany jest do badań w zakresie immunologii, genomiki, proteomiki i biochemii. Badania dowodzą, że wpływ zamrażania i przechowywania próbek w ciekłym azocie nie wpływa negatywnie na ich jakość. Kompleksowy przekrój urządzeń kriogenicznych niezbędnych do zastosowań laboratoryjnych posiada w swojej ofercie firma CryopAL – producent sprzętu kriogenicznego należący do Grupy Air Liquide. 

 

Naczynie dewara a współczesne zbiorniki kriogeniczne

 

Prototyp naczynia Dewara, zwanego obecnie zbiornikiem kriogenicznym, powstał już w XIX wieku. Jego twórcą był James Dewar, który w roku 1898 wykorzystując nowy sposób izolacji – izolację próżniową, opracował naczynie o podwójnych ściankach, spomiędzy których zostało usunięte powietrze. Wynalazek ten pozwolił ówcześnie na magazynowanie skroplonego wodoru i ustanowienie rekordu zimna na poziomie 20,3 K. Obecnie instalacje rektyfikacji powietrza produkują tysiące ton skroplonych gazów na dobę, a współczesne zbiorniki kriogeniczne różnych wielkości pozwalają na ich przechowywanie w warunkach odpowiedniej temperatury i ciśnienia. Bardzo niskie ciśnienie w przestrzeni izolacji próżniowej gwarantuje skrajnie małą przewodność układu, przez to niemal do zera spada możliwość przekazywania ciepła przez konwekcję. Same ścianki urządzeń kriogenicznych są bardzo cienkie i podczas schładzania w momencie napełniania zbiornika wymieniają minimalną ilość ciepł,nie powodując tym samymzauważalnych zmian temperatury nalewanej substancji. Co więcej, powierzchnie ścianek są pokrywane warstwą odbijającą światło celem zredukowania wymiany ciepła przez promieniowanie. Obecnie w laboratoriach biotechnolodzy wykorzystują zbiorniki wykonane ze stali nierdzewnej, które służą nie tylko przechowywaniu ciekłego azotu, ale również zamrożonych zasobów biologicznych. Różnorodność zbiorników kriogenicznych jest ogromna, a postęp kriobiologii pozwala na coraz bardziej skomplikowane procedury badawcze.

 

Rozwiązania Air Liquide

 

Aby sprostać potrzebom laboratoriów i wspomóc ich działalność badawczą, Air Liquide oferuje linię produktów dedykowanych dla zróżnicowanych zastosowań biotechnologicznych. Odpowiednio przystosowane zbiorniki kriogeniczne wykorzystywane są do przechowywania i transportu ciekłego azotu lub próbek biologicznych w słomkach, fiolkach lub torebkach umieszczonych, w zależności od potrzeb, w ciekłym azocie lub jego oparach. Nowoczesne techniki próżniowe pozwalają na dużo dłuższy statyczny czas utrzymywania się ciekłego azotu w zbiornikach, co redukuje straty generowane przez odparowywanie cieczy wskutek kontaktu z cieplejszym otoczeniem, czyli naturalne właściwości fizykochemiczne substancji.

 

Banki krwi pępowinowej, centra zasobów biologicznych, laboratoria inseminacyjne, laboratoria farmaceutyczne

 

Technologie krioprezerwacji Air Liquide na potrzeby banków
krwi pępowinowej, centrów zasobów biologicznych,
laboratoriów inseminacyjnych i farmaceutycznych

 

Na potrzeby banków krwi pępowinowej, centrów zasobów biologicznych, banków materiału biologicznego i genetycznego powstały specjalistyczne zbiorniki kriogeniczne o temperaturze przechowywania -150^°C w oparach ciekłego azotu. W bankach krwi pępowinowej dokonuje się kriokonserwacji krwi pobranej podczas porodu z łożyska i pępowiny. Obecnie na całym świecie magazynowanych jest ponad 450 000 takich próbek. Liczba pacjentów którym przeszczepiono krew pępowinową co roku podwaja się, a tym samy rośnie zapotrzebowanie na zbiorniki kriogeniczne w celu powiększania istniejących państwowych i prywatnych banków.. Pojawienie się planów badawczych poświęconych ochronie próbek biologicznych do badań naukowych, epidemiologicznych, klinicznych i innych spowodowało powstawanie banków komórek macierzystych, biobanków zasobów genetycznych, banków tkanek i komórek oraz laboratoriów inseminacyjnych. Natomiast firmy farmaceutyczne rozpoczęły stosowanie nowych aplikacji tworzenia próbek, wzmagając tym samym kriokonserwację wirusów, szczepionek i komórek macierzystych. Próbki wykorzystywane są do badań klinicznych w farmakologii i toksykologii, służąc wytwarzaniu substancji metodą In-vitro. Odpowiedzią na wszelkie powyższe zapotrzebowania są urządzenia Air Liquide: zbiorniki do przechowywania materiału biologicznego w ciekłym azocie lub jego oparach – duże gabarytowo zbiorniki typu ARPEGE, ESPACE, RCB oraz zamrażarki kriogeniczne NICOOL FREEZAL. Ponadto w przypadku nowych banków materiału biologicznego tworzone są od podstaw instalacje ciekłego azotu „pod klucz”, składające się z przewodów ciśnieniowych, urządzeń kriogenicznych i akcesoriów niezbędnych do codziennego użytkowania instalacji. Rozwiązania Air Liquide to nie tylko rozwijanie gamy urządzeń ze stali nierdzewnej z oprzyrządowaniem do badania wilgotności wnętrza zbiornika oraz jego pojemności, ale i systemy zdalnego informowania o temperaturze i ciśnieniu panujących wewnątrz zbiorników oraz różnego rodzaju i rozmiarów akcesoria instalacyjne.

 

Laboratoria In-vitro

 

Na potrzeby wspomagania ludzkiej prokreacji powstają jednostki In-vitro w których ma miejsce mrożenie i przechowywanie zarodków, tkanek jajników, jąder, oocytów oraz nasienia. Dokonuje się również witryfikacji zarodków. Służą temu kriogeniczne zamrażarki NICOOL FREEZAL oraz zbiorniki do przechowywania  materiału biologicznego typu GT, ARPEGE oraz ESPACE. Urządzenia te zapewniają niezawodność mrożenia i przechowywania w odpowiedniej temperaturze a dostosowane do nich akcesoria telematyczne pozwalają na bieżące monitorowanie wnętrza zbiorników, które po podłączeniu do sieci komputerowej przekazują i zapisują trwale informacje o wszelkich zdarzeniach, zmianach i alarmach. Zbiorniki te cechuje wytrzymałość oraz ergonomiczność kanistrów na próbki, które mogą być w nich przechowywane w fiolkach, słomkach lub torebkach. W zbiornikach GT istnieje ponadto możliwość przechowywania materiału biologicznego bezpośrednio po witryfikacji i zanurzenia ich bezpośrednio w ciekłym azocie.

 

Magazynowanie zarodków, tkanek jajników, jąder, oocytów
oraz nasienia w ciekłym azocie

 

 

Laboratoria inseminacji zwierzęcej

 

Rynek inseminacji zwierzęcej obejmuje hodowców, centra inseminacji zwierzęcej oraz importerów i eksporterów nasienia zwierzęcego. Kriokonserwacja nasienia wielu gatunków zwierząt (w tym bydła, kóz, owiec czy koni) pozwala na późniejsze zapłodnienie samic przez genetycznie udoskonalone nasienie samców, co eliminuje ryzyko chorób czy wad genetycznych oraz pozwala na wyeliminowanie ryzyka zmniejszenia populacji. W celu przechowywania materiału biologicznego w ciekłym azocie oferuje się zbiorniki GT lub RCB – w zależności od potrzeb gabarytowych. Są one wydajne, a ich kanistry cechuje ergonomiczność i precyzyjne oznakowanie.  Przydatnymi okazują się, ponadto, zbiorniki VOYAGEUR służące transportowi próbek w dostosowanych do tego zbiornikach absorbujących ciekły azot i umożliwiających przewożenie materiału biologicznego w fazie gazowej azotu z wyeliminowaniem ryzyka rozlania się czynnika chłodzącego podczas przewozu. Zbiorniki VOYAGEUR są zgodne z międzynarodowymi przepisami mającymi zastosowanie w transporcie materiałów niebezpiecznych drogą lądową (ADR), kolejową (RID) oraz lotniczą (IATA-OACI). Dodatkowo zbiorniki wyposażone są w objęty ochroną patentową system zamknięcia regałów magazynowych kanistrów – clip ®Air Liquide. Dzięki niemu zmaksymalizowano bezpieczeństwo przy obchodzeniu się z zębatką i poszczególnymi boxami regału, umożliwiając użytkownikowi dostęp tylko na jeden poziom regału.

 

Magazynowanie ciekłego azotu – od zbiorników kriogenicznych po skomplikowane instalacje kriogeniczne

 

Bank materiału biologicznego wyposażony w zbiorniki
kriogeniczne Air Liquide

 

W każdego rodzaju laboratoriach niezbędne są zbiorniki do magazynowania ciekłego azotu. W tym zakresie Air Liquide oferuje szeroką gamę urządzeń – od bezciśnieniowych zbiorników typu TR, przez niskociśnieniowe zbiorniki TP wyposażone w głowicę z manometrem i zaworami bezpieczeństwa, po średnio i wysokociśnieniowe zbiorniki magazynowe różnego typu w przypadku większego zapotrzebowania na ciecz. Jeśli jedna, w laboratoriach ciekły azot potrzebny jest do codziennej pracy z materiałem biologicznym, niezbędne mogą się okazać zbiorniki typu AGIL. Służą one do pracy z małymi ilościami ciekłego azotu i mają pojemność od 0,5l do 6l. Zakres temperatury ich pracy wynosi od -200°C do +200°C. Najczęściej stosowane są do transportowania próbek biologicznych w ciekłym azocie pomiędzy laboratoriami w ośrodkach badawczych lub do manualnego obniżania temperatury preparatów biologicznych. Nierzadko stosuje się je również do krótkotrwałego przechowywania niewielkich ilości ciekłego azotu do codziennej pracy w laboratoriach. Bardzo często jednak magazynowanie próbek biologicznych w laboratoriach nie byłoby możliwe bez bardziej skomplikowanych instalacji kriogenicznych, obejmujących duże zbiorniki na ciekły azot o pojemnościach od kilku do nawet kilkunastu tysięcy ton. Technologia, jaką w swojej ofercie posiada Air Liquide, to zbiorniki dwupłaszczyznowe z izolacją próżniowo-perlitową oraz parownice atmosferyczne dostarczane z kompletną armaturą (zawory, zawory bezpieczeństwa, urządzenia pomiarowe, itp.). W zależności od zastosowania zbiorniki magazynowe oferowane są w wersji średniociśnieniowej (maksymalne ciśnienie robocze 17 bar) lub wysokociśnieniowej (maksymalne ciśnienie robocze 35 bar). Dla zastosowań kriogenicznych istnieje również możliwość poboru gazu skroplonego w fazie ciekłej. Air Liquide zapewnia obsługę udostępnianych urządzeń oraz odpowiada za ich rejestrację w Urzędzie Dozoru Technicznego. Co więcej, takie instalacje kriogeniczne wspomagane są dodatkowymi usługami telematycznymi. System MaxiFlo zalecany jest dla dużych przepływów przy ciągłym poborze gazu i zawiera dwa równoległe układy zgazowywania, a opcjonalnie dostępny jest układ automatycznego przełączania parownic. Urządzenia bezpieczeństwa TEMPAL to systemy stałego pomiaru temperatury gazu w procesie, uaktywniające sygnał alarmowy w przypadku przekroczenia dopuszczalnych norm. Usługa OPTIMAL to pakiet usług zapewniający dostawy realizowane na podstawie danych pobieranych z urządzenia do ich teletransmisji, ciągły monitoring krytycznych zmiennych procesu, spersonalizowany dostęp do informacji poprzez stronę internetową oraz interwencje wyprzedzające Air Liquide (jeśli są niezbędne). Air Liquide dostarcza gazy ciekłe do instalacji magazynowania, składających się ze zbiorników kriogenicznych i parownic atmosferycznych. Wielkości zbiorników oraz typy parownic dobierane są w zależności od zapotrzebowania na gaz.

 

Air Liquide naprzeciw rosnącym wymaganiom kriobiologii

 

Nowoczesne technologie kriogeniczne usprawniają pracę laboratoryjną, a rozwiązania teleinformatyczne pozwalają na niezwykle precyzyjną dbałość o zamrożony materiał biologiczny, dzięki czemu przechowywanie próbek w ciekłym azocie jest dla nich bezpieczne.  Air Liquide dostarcza zarówno różnego rodzaju zbiorniki, jak i kompleksowe instalacje kriogeniczne dopasowane do potrzeb laboratoriów. Specjaliści w dziedzinie kriobiologii służą swoją wiedzą i doświadczeniem w doborze odpowiednich urządzeń. Ponadto Air Liquide realizuje dostawy ciekłego azotu, oferując w ten sposób pełen zakres usług w zakresie wspomagania laboratoriów.  Współpracuje w tym zakresie z wieloma jednostkami badawczo-rozwojowymi, wspierając ich pracę swoją technologią i doświadczeniem.

 

---